Около нас има много невъзпяти герои, които изглеждат обикновени, но всъщност тихомълком ни допринасят много. Протеиназа К е „невъзпятият герой“ в индустрията за молекулярна диагностика, въпреки че в сравнение с „големите и могъщи“ в индустрията, протеиназа К е толкова сдържана, че дълго време пренебрегвахме нейното значение. С избухването на новата епидемия от коронавирус търсенето на протеиназа К рязко се увеличи, а предлагането в страната и чужбина значително изостава от потреблението и всички изведнъж осъзнаха, че протеиназа К е толкова важна.
Каква е употребата на протеиназа К?
Протеиназа К е серинова протеаза с протеолитична ензимна активност и може да поддържа активност в широк диапазон от среди (pH (4-12,5), буфер с високо съдържание на сол, висока температура от 70°C и др.). Освен това, активността на протеиназа К не се инхибира от SDS, урея, EDTA, гуанидин хидрохлорид, гуанидин изотиоцианат и др., а определено количество детергент също може да повиши активността на протеиназа К. Протеиназа К се използва в медицинско лечение (дезинфекция от вируси и микроби), храни (омекотяване на месо), кожа (омекотяване на коса), винопроизводство (избистряне на алкохол), приготвяне на аминокиселини (разградени пера), екстракция на нуклеинови киселини, in situ хибридизация и др. Най-често използваното приложение е екстракцията на нуклеинови киселини.
Протеиназа К може да ензимолизира всички видове протеини в пробата, включително тези хистони, които са здраво свързани с нуклеинови киселини, така че нуклеиновите киселини да могат да бъдат освободени от пробата и да попаднат в екстракта, улеснявайки следващата стъпка на екстракция и пречистване. При откриването на вирусна нуклеинова киселина, протеиназа К е един от важните компоненти в разтвора за вземане на проби от вируса. Протеиназа К може да разцепи и инактивира обвивния протеин на вируса, което е по-безопасно по време на етапа на транспортиране и откриване; освен това, протеиназа К може също да разгради РНК-аза, предотвратявайки разграждането на вирусната РНК и улеснявайки откриването на нуклеинова киселина.
Нощната слава на протеиназа К
Независимо дали в областта на научните изследвания или в областта на ин витро диагностиката, екстракцията на нуклеинови киселини е най-основният експеримент, така че протеиназа К винаги е била много важна. В миналото обаче протеиназа К е била далеч по-малко позната, отколкото е била нейната роля. Голяма част от това се дължи на факта, че съотношението между търсене и предлагане на протеиназа К е било много стабилно. Малко хора биха си помислили, че предлагането на протеиназа К ще бъде проблем.
С избухването на новата епидемия от коронавирус, търсенето на тестове за нуклеинови киселини рязко се увеличи. Към края на юни 2020 г. Китай е завършил близо 90 милиона нови тестове за коронавирус и това число е още по-тревожно в световен мащаб. В експериментите за екстракция на нуклеинови киселини работната концентрация на протеиназа К е около 50-200 μg/mL. Обикновено са необходими около 100 μg протеиназа К, за да се екстрахира проба от нуклеинова киселина. В реална употреба, за да се увеличи ефективността на екстракцията на нуклеинова киселина, често се използва по-голямо количество протеиназа К. Откриването на нуклеинови киселини на новия коронавирус доведе до голямо търсене на протеиназа К. Първоначалният баланс между търсене и предлагане на протеиназа К бързо беше нарушен и протеиназа К се превърна във важен материал за предотвратяване на епидемии за една нощ.
Трудности при производството на протеиназа К
Въпреки че с развитието на епидемията важната стойност на протеиназа К е била оценена от хората, е неудобно, че поради прекомерната ниска популярност на протеиназа К, малко местни компании са се занимавали с производството на протеиназа К. Когато хората искат да установят производство на протеиназа К. По време на производствения процес е установено, че протеиназа К е изключително специален протеин. Изключително трудно е да се разшири производственият капацитет на протеиназа К за кратък период от време.
Производството на протеиназа К в голям мащаб е изправено пред следните трудности
1. Ниска експресия
Протеиназа К може неспецифично да разгради повечето протеини и да причини сериозна токсичност за експресиращата клетка гостоприемник. Следователно, нивото на експресия на протеиназа К обикновено е много ниско. Скринингът на експресионни системи и щамове, които силно експресират протеиназа К, обикновено изисква по-дълъг цикъл.
2. Остатъци от пигменти и нуклеинови киселини
Ферментацията в голям мащаб въвежда голямо количество пигмент и остатъци от нуклеинова киселина на гостоприемника. Трудно е да се отстранят тези примеси с прост процес на пречистване, а сложното пречистване увеличава разходите и намалява степента на извличане.
3. Нестабилност
Протеиназа К не е достатъчно стабилна, може да се самоензимизира и е трудно да се съхранява стабилно при 37°C за дълго време без защитен агент.
4. Лесно се утаява
При приготвянето на лиофилизиран прах от протеиназа К, за да се гарантира, че съдържанието на твърдо вещество в протеиназа К е високо, е необходимо да се добави лиофилизиран защитен агент с висока концентрация. Но когато концентрацията на протеиназа К достигне 20 mg/mL и повече, лесно се образува утайка, което създава големи трудности при лиофилизацията на протеиназа К с високо съдържание на твърдо вещество.
5. Голяма инвестиция
Протеиназа К има силна протеазна активност и може да хидролизира други протеази в лабораторията. Следователно, протеиназа К изисква специализирани производствени зони, оборудване и персонал за научноизследователска и развойна дейност и производство.
Разтвор на протеиназа К на XD BIOCHEM
XD BIOCHEM разполага със зряла платформа за експресия и пречистване на протеини и има богат опит в експресията и пречистването на рекомбинантни протеини и оптимизирането на производствените процеси. Чрез бързото сформиране на екип за изследвания и разработки, мащабният производствен процес на протеиназа К е преодолян. Месечното производство на лиофилизиран прах е над 30 кг. Продуктът има стабилна производителност, висока ензимна специфична активност и няма остатъци от цитохром и нуклеинова киселина на гостоприемника. Свържете се с XD BIOCHEM. Получете пробен пакет (имейл:sales@xdbiochem.comТел.: +86 513 81163739).
Техническите решения на XD BIOCHEM включват
Чрез интеграция на многокопийни плазмиди се селектират щамове с висока експресия с ниво на експресия от 8g/L, което преодолява проблема с ниското ниво на експресия на протеиназа К.
Чрез установяването на многоетапен процес на пречистване, остатъците от цитохрома и нуклеинова киселина на протеиназа К на гостоприемника бяха успешно отстранени под стандартната стойност.
Чрез високопроизводителен скрининг на защитни буферни формулировки беше избран буфер, който може стабилно да съхранява протеиназа К при 37°C.
Скрининг буферите преодоляват проблема, че протеиназа К лесно се агрегира и утаява при високи концентрации, и полагат основите за лиофилизацията с високо съдържание на твърди вещества на протеиназа К.
XD BIOCHEM протеиназа К проба
Тест за стабилност на протеиназа К XD BIOCHEM: няма да има значителна промяна в активността след 80 дни при стайна температура
Тест за стабилност на XD BIOCHEM протеиназа К: няма да има значителна промяна в активността след 80 дни при стайна температура.
Сравнение на ефекта на екстракция на нуклеинови киселини с XD BIOCHEM протеиназа K и конкурентни продукти. В процеса на екстракция на нуклеинови киселини се използват съответно XD BIOCHEM и конкурентна протеиназа K. Ефективността на екстракция на XD BIOCHEM протеиназа K е по-висока, а Ct стойността на целевия ген е по-ниска.
Време на публикуване: 31 декември 2021 г.