IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид) е аналог на β-галактозидазния субстрат, който е силно индуцируем. При индуциране на IPTG, индукторът може да образува комплекс с репресорния протеин, така че конформацията на репресорния протеин да се промени, така че той да не може да се комбинира с целевия ген и целевият ген да се експресира ефективно. И така, как трябва да се определи концентрацията на IPTG по време на експеримента? Колкото по-голяма, толкова по-добре?
Първо, нека разберем принципа на IPTG индукция: Лактозният оперон (елемент) на E. coli съдържа три структурни гена, Z, Y и A, които кодират съответно β-галактозидаза, пермеаза и ацетилтрансфераза. lacZ хидролизира лактозата до глюкоза и галактоза или до ало-лактоза; lacY позволява на лактозата от околната среда да премине през клетъчната мембрана и да навлезе в клетката; lacA прехвърля ацетилната група от ацетил-CoA към β-галактозид, което включва премахване на токсичния ефект. Освен това има операционна последователност O, начална последователност P и регулаторен ген I. Генният код I е репресорен протеин, който може да се свърже с позиция O на операторната последователност, така че оперонът (meta) да бъде репресиран и изключен. Съществува и място за свързване на катаболния генен активаторен протеин - CAP място за свързване преди иницииращата последователност P. P последователността, O последователността и CAP мястото за свързване заедно образуват регулаторната област на lac оперона. Кодиращите гени на трите ензима се регулират от един и същ регулаторен регион, за да се постигне координирана експресия на генни продукти.
При липса на лактоза, лактозата (мета) е в състояние на репресия. По това време лактозата (мета) репресор, експресиран от I последователността под контрола на PI промоторната последователност, се свързва с O последователността, което предотвратява свързването на РНК полимеразата с P последователността и инхибира инициирането на транскрипцията; когато има лактоза, лактозата (мета) може да бъде индуцирана. В тази оперонна (мета) система истинският индуктор не е самата лактоза. Лактозата навлиза в клетката и се катализира от β-галактозидаза, за да се превърне в алолактоза. Последната, като индукторна молекула, се свързва с репресорния протеин и променя конформацията на протеина, което води до дисоциация на репресорния протеин от O последователността и транскрипция. Изопропилтиогалактозидът (IPTG) има същия ефект като алолактозата. Той е много мощен индуктор, който не се метаболизира от бактериите и е много стабилен, така че се използва широко в лаборатории.
Как да определим оптималната концентрация на IPTG? Вземете за пример E. coli.
Генетично модифицираният щам E. coli BL21, съдържащ положителния рекомбинантен pGEX (CGRP/msCT), беше инокулиран в течна среда LB, съдържаща 50μg·mL-1 Amp, и култивиран за една нощ при 37°C. Горната култура беше инокулирана в 10 бутилки от 50mL прясна течна среда LB, съдържаща 50μg·mL-1 Amp, в съотношение 1:100 за разширяване на културата и когато стойността на OD600 беше 0.6~0.8, беше добавен IPTG към крайната концентрация. Тя е 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. След индукция при същата температура и същото време, от него е взет 1 mL от бактериалния разтвор и бактериалните клетки са събрани чрез центрофугиране и подложени на SDS-PAGE, за да се анализира влиянието на различните концентрации на IPTG върху експресията на протеини, след което да се избере концентрацията на IPTG с най-голяма експресия на протеини.
След експерименти ще се установи, че концентрацията на IPTG не е възможно най-висока. Това е така, защото IPTG има известна токсичност за бактериите. Превишаването на концентрацията също ще убие клетката; и като цяло, ние се надяваме, че колкото повече разтворим протеин се експресира в клетката, толкова по-добре, но в много случаи, когато концентрацията на IPTG е твърде висока, ще се образува голямо количество включвания. Тялото, но количеството на разтворимия протеин намалява. Следователно, най-подходящата концентрация на IPTG често не е колкото по-голяма, толкова по-добре, а колкото по-ниска е концентрацията.
Целта на индукцията и култивирането на генетично модифицирани щамове е да се увеличи добива на целевия протеин и да се намалят разходите. Експресията на целевия ген се влияе не само от собствените фактори на щама и експресионния плазмид, но и от други външни условия, като концентрацията на индуктора, температурата на индукция и времето на индукция. Следователно, като цяло, преди да се експресира и пречисти неизвестен протеин, е най-добре да се проучи времето на индукция, температурата и концентрацията на IPTG, за да се изберат подходящите условия и да се получат най-добри експериментални резултати.
Време на публикуване: 31 декември 2021 г.