Дитиотреитолът (DTT) е често използван редуциращ агент, известен още като новата зелена добавка. Това е нискомолекулно органично съединение с две меркаптанови групи (-SH). Поради своите редуциращи свойства и стабилност, DTT се използва широко в биохимични и молекулярно-биологични експерименти.
Основната роля на DTT е да редуцира дисулфидните връзки в протеините и други биомолекули. Дисулфидната връзка е важна част от сгъването и стабилността на протеините, но при определени експериментални условия, като например редуцируем SDS-PAGE анализ, протеинова рекомбинация и сгъване, е необходимо да се редуцира дисулфидната връзка до две тиолови групи, за да се разкрие пространствената структура на протеина. DTT може да реагира с дисулфидните връзки, за да ги редуцира до меркаптанови групи, като по този начин отваря пространствената структура на протеина и го прави лесен за анализ и манипулиране.
DTT може да се използва и за защита на ензимната активност и стабилност. При някои ензимно-катализирани реакции, активността на ензима може да бъде намалена от окислителя. DTT може да реагира с окислителите, за да ги редуцира до безвредни вещества, като по този начин защитава активността и стабилността на ензима.
В сравнение с традиционните редуциращи агенти като β-меркаптоетанол (β-ME), DTT се счита за по-безопасен и по-стабилен редуциращ агент. Той е не само стабилен във воден разтвор, но и запазва редуциращите си свойства при висока температура и киселинно-алкални условия.
Употребата на DTT е сравнително проста. Като цяло, DTT се разтваря в подходящ буфер и след това се добавя към експерименталната система. Оптималната концентрация на DTT трябва да се определи според специфичния експеримент и обикновено се използва в диапазона от 0,1-1 mM. По-ниските концентрации могат да намалят неблагоприятните ефекти върху клетъчния растеж и да намалят цитотоксичността, дължаща се на свръхекспресия на целевите протеини. По-високите концентрации могат да причинят прекомерно метаболитно натоварване на клетките, което да повлияе на клетъчния растеж и ефективността на експресия.
Оптималната концентрация може да се определи чрез оценка на нивото на експресия на целевия протеин чрез провеждане на IPTG индукционни тестове при различни концентрации. Тестове с малки култури могат да се проведат с използване на диапазон от IPTG концентрации (напр. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM и др.), а ефектът на експресия при различни концентрации може да се оцени чрез откриване на нивото на експресия на целевия протеин (напр. Western blot или флуоресцентно откриване). Според експерименталните резултати, концентрацията с най-добър ефект на експресия е избрана като оптимална концентрация.
Освен това, можете да се обърнете към съответната литература или опита на други лаборатории, за да разберете често използвания диапазон на концентрация на IPTG при подобни експериментални условия, и след това да го оптимизирате и коригирате според експерименталните нужди.
Важно е да се отбележи, че оптималната концентрация може да варира в зависимост от различните експресионни системи, целевите протеини и експерименталните условия, така че е най-добре да се оптимизира за всеки отделен случай.
В обобщение, DTT е често използван редуциращ агент, който може да се използва за намаляване на дисулфидните връзки в протеини и други биомолекули и за защита на ензимната активност и стабилност. Той е широко използван в експерименти по биохимия и молекулярна биология.
Време на публикуване: 28 септември 2023 г.