Дитиотреитол (DTT) е често използван редуциращ агент, известен също като новата зелена добавка.Това е нискомолекулно органично съединение с две меркаптанови групи (-SH).Поради своите редуциращи свойства и стабилност, DTT се използва широко в биохимичните и молекулярно-биологичните експерименти.
Основната роля на DTT е да редуцира дисулфидните връзки в протеини и други биомолекули.Дисулфидната връзка е важна част от нагъването и стабилността на протеина, но при определени експериментални условия, като редуцируем SDS-PAGE анализ, протеинова рекомбинация и нагъване, е необходимо да се редуцира дисулфидната връзка до две тиолови групи, за да се разкрие пространствената структура на протеинът.DTT може да реагира с дисулфидни връзки, за да ги редуцира до меркаптанови групи, като по този начин отваря пространствената структура на протеина и го прави лесен за анализиране и манипулиране.
DTT може също да се използва за защита на ензимната активност и стабилност.При някои ензимно-катализирани реакции активността на ензима може да бъде намалена от окислителя.DTT може да реагира с оксиданти, за да ги редуцира до безвредни вещества, като по този начин защитава активността и стабилността на ензима.
В сравнение с традиционните редуциращи агенти като β-меркаптоетанол (β-ME), DTT се счита за по-безопасен и по-стабилен редуциращ агент.Той не само е стабилен във воден разтвор, но също така поддържа своите редуциращи свойства при висока температура и киселинно-алкални условия.
Използването на DTT е относително лесно.Като цяло DTT се разтваря в подходящ буфер и след това се добавя към експерименталната система.Оптималната концентрация на DTT трябва да се определи според конкретния експеримент и обикновено се използва в диапазона от 0,1-1 mM.По-ниските концентрации могат да намалят неблагоприятните ефекти върху клетъчния растеж и могат да намалят цитотоксичността поради свръхекспресия на целевите протеини.По-високите концентрации могат да причинят прекомерно клетъчно метаболитно натоварване, засягащо клетъчния растеж и ефективността на експресията.
Начинът за определяне на оптималната концентрация може да бъде да се оцени нивото на експресия на целевия протеин чрез провеждане на IPTG индукционни тестове при различни концентрации.Културни тестове в малък мащаб могат да се извършат, като се използва диапазон от концентрации на IPTG (напр. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM и т.н.) и ефектът на експресия при различни концентрации може да бъде оценен чрез откриване на нивото на експресия на целевия протеин (напр. Western блот или флуоресцентно откриване).Според експерименталните резултати, концентрацията с най-добър ефект на експресия е избрана като оптимална концентрация.
Освен това можете също да се обърнете към съответната литература или опита на други лаборатории, за да разберете често използвания диапазон на концентрация на IPTG при подобни експериментални условия и след това да оптимизирате и коригирате според експерименталните нужди.
Важно е да се отбележи, че оптималната концентрация може да варира в зависимост от различните експресионни системи, целевите протеини и експерименталните условия, така че е най-добре да се оптимизира за всеки отделен случай.
В обобщение, DTT е често използван редуциращ агент, който може да се използва за намаляване на дисулфидните връзки в протеини и други биомолекули и за защита на ензимната активност и стабилност.Той е широко използван в биохимичните и молекулярно-биологичните експерименти.
Време на публикуване: 28 септември 2023 г